جداسازی و همسانه سازی ژن پیرووات دکربوکسیلاز(pdc) از باکتری zymomonas mobilis در باکتری e.coli bl21

تولید اتانول از زیست توده یکی از راهبردهای بی نظیر و سودمند از لحاظ اقتصادی و محیطی است و می تواند به عنوان یک سوخت پاک و ایمن، جایگزین سوخت های فسیلی مورد ملاحظه و بررسی قرار گیرد. در سراسر جهان مقدار زیادی از زیست توده های لیگنوسلولزی موجود است که می تواند به منظور استخراج و تولید اتانول زیستی مورد استفاده قرار گیرد. اخیراً پیشرفت های قابل ملاحظه ای در تولید اتانول زیستی از مواد لیگنوسلولزی بوجود آمده است. با توجه به این مساله که تولید این سوخت ها توسط موجودات زنده میکروبی انجام می گیرد، بخش مهمی از تحقیقات به انتخاب میکروارگانیسم های برتر جهت تولید و افزایش توان تولیدی آنها اختصاص یافته است. در این تحقیق ابتدا مسیر متابولیسمی تولید اتانول زیستی در باکتری های zymomonas mobilis وescherchia coli شناسایی گردید و ژن های دخیل در تولید اتانول زیستی ردیابی شدند. سپس ژن پیروات دکربوکسیلاز (pdc) از باکتری zymomonas mobilis به دلیل اینکه اولین آنزیم و کلیدیترین آنزیم در مسیر تولید اتانول زیستی می باشد انتخاب گردید. جهت همسانه سازی ژن pdc، با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن pdc و واکنش pcr این ژن جداسازی شد و سپس ژن و پلایمید pet 28a هر دو توسط آنزیم های برشی sal i و xho i هضم گردیدند. سپس محصولات هضم توسط آنزیم t4 dna ligase به مدت 12 ساعت در دمای c ?? 16 به هم متصل شدند. جهت تایید تراریزش باکتری e.coli چهار آزمون شامل، کشت کلونی ها در محیط lb (حاوی mg/l 50 کانامایسین)، colony pcr، pcr توسط آغازگر پروموتور t7 و آغازگر برگشت ژن pdc بر روی پلاسمید نوترکیب و نهایتاً هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب توسط آنزیم های sal i و xho i انجام گردید. نتایج کشت باکتری های تراریخت بر روی محیط حاوی کانامایسین نشان داد که تنها کلونی های محدودی قادر به رشد می باشند که حاوی پلاسمید pet می باشند. در مرحله بعدی نتایج colony pcr با پرایمرهای اختصاصی ژن نشان داد که باند مربوط به ژن pdc به اندازه 1700 جفت باز قابل مشاهده می باشد. pcr پلاسمید نوترکیب توسط آغازگرهای رفت پروموتور t7 و آغازگر برگشت ژن pdc، جهت صحیح درج ژن در داخل پلاسمید را ثابت و باندی به اندازه bp1885 را در الکتروفورز ژل آگارز ?1 را نشان داد و در نهایت نتایج هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب توسط آنزیم های sal i و xho i باندهای مشابهی را آشکار کرد.